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FORSCHUNGSBERICHT 1999-2001

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DFG-Forschergruppe: Pathogenese der spinozerebellären Ataxie Typ 3 (SCA3)

Allgemeine Angaben:
Neurologische Klinik, UKB Sigmund-Freud-Str.25, 53105 Bonn
Telefon: (0228)/2875736
Fax: (0228)/2875024
eMail: neurology@uni-bonn.de
WWW: http://www.meb.uni-bonn.de/neurologie/index.html

Sprecher:
Professor Thomas Klockgether

Projektleiter / Beteiligte Hochschullehrer:
Dr. rer. nat. Annett Böddrich
Dr. rer. nat. Peter Breuer
Dr. rer. nat. Bernd Evert
Prof. Dr. rer. nat. Ulrich Hartl
Prof. Dr. med. Thomas Klockgether
Prof. Dr. med. Olaf Riess
Dr. rer. nat. Ina Schmitt
Prof. Dr. rer. nat. Erich Wanker
PD Dr. med. Ullrich Wüllner
Prof. Dr. rer. nat. Andreas Zimmer

Projektbereiche und Teilprojekte:

1:  Charakterisierung und Identifizierung von Genen, deren Expression durch expandiertes Ataxin-3 beeinflußt wird (Prof. Dr. med. Thomas Klockgether; PD Dr. med. Ullrich Wüllner ; Dr. rer. nat. Bernd Evert)

2:  Aggregation des Ataxin-3 Proteins in vitro und in verschiedenen Zellkultursystemen (Prof. Dr. Erich E. Wanker, Max-Planck Institut für Molekulare Genetik)

3:  Inaktivierung des SCA3-Gens in der Maus (Prof. Dr. rer. nat. Andreas Zimmer, Dr. rer. nat. Ina Schmitt)

4:  Charakterisierung eines induzierbaren transgenen Mausmodells der SCA3 (Prof. Dr. med. Olaf Riess,)

5:  Bedeutung molekularer Chaperone für das Aggregationsverhalten und die metabolische Stabilität von Ataxin-3 (Prof. Dr. rer. nat. Ulrich Hartl; Dr. rer. nat. P. Breuer)

Forschungsprogramm:

Pathogenese der spinozerebellären Ataxie Typ 3 (SCA3)

Die spinozerebelläre Ataxie Typ 3 (SCA3) ist die weltweit häufigste autosomal dominant vererbte Ataxie. Sie gehört zu einer Gruppe autosomal dominant vererbter, neurodegenerativer Erkrankungen, die durch instabile, expandierte CAG-Repeat-Mutationen in kodierenden Genregionen verursacht werden. Den von den mutierten Genen kodierten, expandierten Proteinen kommt nach heutiger Auffassung eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese zu. Ursache der Neurodegeneration sind aber vermutlich nicht ein Mangel oder eine fehlende Funktion, sondern eine neu erworbene, schädigende Funktion (toxic gain of function) der jeweiligen Genprodukte. Das Genprodukt des SCA3-Gens wird als Ataxin-3 bezeichnet. Seine physiologische Funktion ist unbekannt. Obwohl heute Einigkeit besteht, daß Fehlfaltung und Aggregationsneigung der expandierten Proteine sowie abnorme Interaktionen mit anderen zelleigenen Proteinen von grundsätzlicher Bedeutung für die Entstehung der Neurodegeneration sind, sind die pathogenetischen Mechanismen, die zu neuronaler Dysfunktion und nachfolgend neuronalem Zelltod führen, weiterhin unbekannt. Bei SCA3 kommt es wie bei einer Reihe anderer CAG-Repeat-Erkrankungen zu einer Translokation des expandierten Proteins in den Kern und zur Bildung neuronaler intranukleärer Inklusionen (NII). Untersuchungen an Modellen der Huntington´schen Krankheit (HD) und der SCA1 deuten aber daraufhin, daß NII nicht unmittelbar für die Pathogenese von CAG-Repeat-Erkrankungen verantwortlich sind (Saudou et al. 1998; Klement et al. 1998). Eine attraktive und inzwischen durch erste experimentelle Befunde belegte Hypothese zur Pathogenese von CAG-Repeat-Erkrankungen ist, daß expandierte, Polyglutamin-haltige Proteine eine veränderte Genexpression bewirken. Zahlreiche Transkriptionsfaktoren besitzen selbst Polyglutamin-reiche Regionen. Die Expansion der Polyglutamin-Domäne in Ataxin-3 könnte dazu führen, daß Ataxin-3 mit anderen Polyglutamin-haltigen Transkriptionsfaktoren interagiert und deren Aktivität beeinflußt. Während es bislang keine Belege dafür gibt, daß Ataxin-3 direkt an DNA bindet und auf diesem Weg die Transkription beeinflußt, gibt es direkte Hinweise für eine Interaktion von Ataxin-3 mit Transkriptionsfaktoren. Solche Interaktionen werden dadurch begünstigt, daß sowohl normales als auch expandiertes Ataxin-3 nach nukleärer Translokation eine neue Konformation einnehmen, die besonders die Polyglutamin-Domäne für assoziierende Proteine zugänglich macht (Tait et al. 1998; Perez et al. 1999). In humanen SCA3-Gehirnschnitten kolokalisiert der Transkriptionsfaktor TATA-binding protein (TBP) und in einem SCA3-Drosophila-Modell das nukleäre Protein eyes absent protein (EYA) mit den NII (Perez et al., 1998). Die mögliche funktionelle Bedeutung der Interaktion mit TBP wird dadurch unterstrichen, daß eine CAG-Repeat-Expansion im TBP-Gen Ursache einer seltenen Form einer früh beginnenden Ataxie ist (Koide et al. 1999). Die Tatsache, daß nukleäre Proteine über ihre Polyglutamindomäne mit in die NII aggregiert werden, macht deutlich, daß bei der SCA3-Pathogenese transkriptionelle Veränderungen durch den Verlust wichtiger Kernproteine hervorgerufen werden könnten. Andere nicht über die Polyglutamindomäne assoziierende Proteine sind die humanen DNA-Reparaturproteine HHR23A und HHR23B, die spezifisch an einen N-terminalen Bereich von normalem und expandiertem Ataxin-3 binden (Wang et al., 2000). Da HHR23A ebenfalls in NIs aggregiert, die von expandiertem Ataxin-3 gebildet werden, existiert neben der Polyglutamin-assoziierten auch eine Aggregation nukleärer Proteine über nicht Polyglutamin-enthaltende Bereiche von Ataxin-3. Darüberhinaus assoziieren NII, die von Ataxin-1, Ataxin-3 oder Ataxin-7 gebildet werden, vorwiegend in den promyelocytic leukaemia protein-assoziierten onkogenen Domänen des Zellkerns, die besonders wichtig für die transkriptionelle Regulation sind (Chai et al. 1999; Skinner et al. 1997; Kaytor et al. 1999). Diese Befunde und die Aggregation verschiedener Proteine durch expandiertes Ataxin-3 unterstützten die Annahme, daß eine transkriptionelle Störung an der Pathogenese der SCA3 beteiligt sein könnte.

Projektbereich 1: Zahlreiche Beobachtungen deuten daraufhin, daß expandierte, Polyglutamin-haltige Proteine eine veränderte Genexpression hervorrufen. Mögliche Mechanismen sind abnorme Interaktionen mit Transkriptionsfaktoren und eine gestörte proteasomale Funktion der Zelle. Wir haben in unseren Vorarbeiten eine Reihe von Genen identifiziert, die in Ataxin-3-überexprimierenden CSM14.1-Zellen und in pontinen Neuronen von SCA3-Patienten aufreguliert sind. Erstes Ziel des beantragten Projekts ist es, ein umfassenderes Bild der veränderten Genexpression bei SCA3 zu gewinnen. Dazu soll einerseits der Zeitverlauf der Geninduktion der bereits identifizierten aufregulierten Gene untersucht und andererseits durch eine weitere subtraktive Hybridisierung im CSM14.1-Zellmodell gezielt nach abregulierten Genen gesucht werden. Außerdem sollen die bisherigen Arbeiten im PC12-Zellmodell und in den transgenen SCA3-Mäusen überprüft werden. Änderungen der Genexpression, die konsistent in mehreren Krankheitsmodellen gefunden werden, sind von besonderer Relevanz für die Pathogenese der SCA3 und könnten von erheblicher therapeutischer Bedeutung sein. Im zweiten Teil des Projekts sollen die funktionellen Zusammenhänge der aufregulierten Mediatoren in den SCA3-Q70-Zellinien untersucht werden. Ein wichtiger Punkt dieser Untersuchungen befaßt sich mit der funktionellen Bedeutung der erhöhten MMP-2-Expression in der SCA3-Pathogenese. Daher soll die transkriptionelle und posttranslationale Regulationskontrolle der MMP-2 in den SCA3-Q70-Zellinien eingehend untersucht werden. Die MMP-2 sowie IL-1ß stellen im weiteren auch die Angriffspunkte zur Entwicklung potentieller neuroprotektiver Strategien dar.

Projektbereich 2: Die Ziele des Projekts bestehen in der (1) Untersuchung der Aggregation von Ataxin-3-Proteinen mit unterschiedlich langen Polyglutamin-Abschnitten in vitro, (2) der Expression von Ataxin-3-Proteinen in Säugetierzellen und Analyse der Proteinaggregation in verschiedenen Zellkompartimenten und der (3) Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die an Ataxin-3 binden und dessen Aggregation beeinflussen. Zunächst sollen Glutathion S-Transferase-Ataxin-3 (GST-Ataxin-3) Fusionsproteine mit unterschiedlich langen Glutaminketten hergestellt und mittels Affinitätschromatographie gereinigt werden. Die Proteine sollen dann für die Untersuchung der Proteinaggregation in vitro eingesetzt werden. Die Bildung von unlösichen Ataxin-3 Aggregaten soll mit einer Filtrationsmethode und mittels Elektronenmikroskopie untersucht werden. Zum Beispiel soll die Glutaminkettenlänge, die für die Bildung von unlöslichen Ataxin-3 Aggregaten essentiell ist, bestimmt werden. Außerdem soll festgestellt werden, ob die Ataxin-3 Proteinaggregate eine fibrilläre Struktur aufweisen. Für die Analyse der Proteinaggregation in Säugetierzellen sollen Ataxin-3 Proteine mit Glutaminketten im normalen (23 Glutamine) und pathologischen Bereich (50-80 Glutamine) in COS7- und 293T-Zellen exprimiert werden. Die Bildung von löslichem und unlöslichem Ataxin-3 soll mittels SDS-PAGE, Western blotting und biochemischen Methoden untersucht werden. Weiterhin soll mit Hilfe der Immunofluoreszenz-mikroskopie und einer Filtrationsmethode die Bildung von unlöslichen Proteinaggregaten in verschiedenen Zellkompartimenten analysiert werden. Schließlich soll mittels Affinitätschromatographie versucht werden, Proteine zu isolieren, die an das Ataxin-3 Protein binden. Dazu sollen Ataxin-3 Proteine an eine Matrix gebunden und mit verschiedenen Proteinextrakten inkubiert werden. Proteine, die mit dem Ataxin-3 Protein in Wechselwirkung treten, können durch Zentrifugation selektiv angereichert werden. Danach werden sie mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch tryptischen Verdau spezifische Peptide generiert. Mit Hilfe der Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) kann dann die Masse der Peptide und darüber die Identität der Proteine bestimmt werden.

Projektbereich 3: Ziel des Projekts ist, das SCA3-Gen der Maus durch gezielte Mutagenese zu inaktivieren. Mit Hilfe dieser knockout-Maus sollen Hinweise auf die physiologische Funktion des Ataxin-3 gewonnen werden. Die Inaktivierung eines spezifischen Gens erfolgt über eine homologe Rekombination zwischen der Zielregion in der genomischen DNA und einem Vektorkonstrukt. Das Konstrukt, ein sogenannter Replacement-Vektor, enthält zwei Selektionsgene und wird in ES-Zellen transfiziert. 1. Das Neomycin-Gen: Nur die ES-Zellen, die das Konstrukt enthalten, können in einem Neomycin-haltigen Medium überleben. 2. Das Herpes simplex Virus Thymidinkinase-Gen (HSV-tk): Nur die ES-Zellen werden selektioniert, die das HSV-tk Gen des Vektors nicht mehr besitzten, weil nur die Zielregion durch homologe Rekombination in ihre genomische DNA integriert wurde. Das Neomycin-Gen ist von Bereichen des Zielgens flankiert, gelangt durch den Austausch in die genomische Umgebung des internen Gens und führt so zu dessen Inaktivierung. Neben diesem konventionellen System zur Erzeugung von knockout-Mäusen besteht außerdem die Möglichkeit, unter Verwendung des cre/lox-Systems, eine Mauslinie zu generieren, in der die Inaktivierung des Zielgens nur an einem bestimmten Ort oder ab einem bestimmten Zeitpunkt stattfindet 15. Cre ist ein Protein des Bakteriophagen P1, das sowohl in Pro- als auch in Eukaryonten eine spezifische Rekombination zwischen den 34 bp-langen loxP-Stellen katalysiert. Für eine zeitspezifische Inaktivierung des Zielgens werden zunächst durch homologe Rekombination Mäuse generiert, die zwei loxP-Stellen im Zielgen enthalten. Eine zweite Mauslinie ist erforderlich, die transgen für einen Vektor ist, der die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors enthält. Wenn diese beiden Mauslinien gekreuzt werden entsteht nach Aktivierung des Promotors eine knockout-Maus. Dieser Ansatz ist in seiner Durchführung deutlich aufwendiger und soll daher nur angewendet werden, falls die konventionell erzeugten knockout-Mäuse embryonal lethal sein sollten.

Projektbereich 4: Ziel dieses Projektes ist die Generierung und Verhaltenscharakterisierung eines transgenen Mausmodells für die spinozerebelläre Ataxie Typ 3 (SCA3). Gegenwärtig existiert nur ein einziges transgenes Mausmodell der SCA3, bei dem das Transgen unter Kontrolle eines Purkinjezell-spezifischen Promotors exprimiert wird. Gerade Purkinjezellen sind jedoch bei der SCA3 nicht betroffen, so daß dieses Modell nicht für die SCA3 geeignet ist. Unter Kontrolle des neuronal ubiquitär exprimierenden Huntingtin-Promotors sollen transgene Mäuse mit normaler bzw. expandierter full length-Ataxin-3-cDNA generiert werden. Es sollen einfach transgene Tiere generiert werden, um in zukünftigen Projekten zahlreiche Optionen der Kreuzung mit weiteren transgenen Tieren zu schaffen, die pathogenetisch bedeutsame Gene überexprimieren. Für die SCA3 konnte bisher nicht geklärt werden, ob eine nukleäre Lokalisation des mutierten Genproduktes für die Pathogenese unabdingbar ist. Daher sollen weitere transgene Tierlinien mit expandierten Konstrukten geschaffen und charakterisiert werden, denen ein nukleäres Import- bzw. Exportsignal angefügt wird. Besonders wichtig werden detaillierte neurologische und Verhaltensstudien in verschiedenen Altersstadien sein, die auch als Basis für künftige therapeutische Ansätze dienen sollen.


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