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FORSCHUNGSBERICHT 1999-2001

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DFG-Forschergruppe: Aptamere, Arzneistoffe, Signalmoleküle: Kombinatorische Analyse von Zellfunktionen und Organogenese

Allgemeine Angaben:
Institut für Zoophysiologie; Sekretariat Entwicklungsbiologie: Frau Müller Poppeldsdorfer Schloss, 53115 Bonn
Telefon: (0228)/73-4621
Fax: (0228)/73-4480
eMail: m.hoch@uni-bonn.de
WWW: http://www.for425.uni-bonn.de

Sprecher:
Prof. Dr. Michael Hoch

Projektleiter / Beteiligte Hochschullehrer:
Prof. Dr. Michael Famulok Fachgruppe Chemie
Prof. Dr. Michael Hoch Fachgruppe Biologie
Prof. Dr. Christa E. Müller Fachgruppe Pharmazie
Prof. Dr. Andreas Zimmer Medizin

Projektbereiche und Teilprojekte:

A2:  Funktionelle Analyse von Zell/Zell-Kommunikationsprozessen bei der Organentwicklung im Drosophila-Embryo (Hoch, Entwicklungsbiologie)

A4:  Signalmechanismen bei der Differenzierung somatosensorischer Neurone (Zimmer, Medizinische Neurobiologie)

B1:  In vitro-Selektion und in vivo-Expression von Aptameren zur Analyse der molekularen Mechanismen der Zell/Zell-Kommunikation bei Drosophila und anderen zellulären Systemen (Famulok, Biochemie und Bioorganische Chemie)

B2:  Entwicklung und Charakterisierung Subtypen-selektiver P2-Purin- und Pyrimidin-Rezeptorliganden und Untersuchungen zur Funktion der Rezeptoren in der Zellproliferation und -differenzierung (Müller, Pharmazeutische Chemie)

Forschungsprogramm:

Die Entschlüsselung und molekulare Charakterisierung von Faktoren und Wirkmechanismen, die Zellfunktionen regulieren, gehörte in den letzten zwei Dekaden zu den zentralen Themen der genetischen und entwicklungsbiologischen Forschung. Dabei gelang der Nachweis, daß Regulationsfaktoren und ganze Signalkaskaden existieren, die über Spezies-Grenzen hinweg evolutionär konserviert sind und Musterbildung und Zelldifferenzierung bei der Gestaltbildung koordinieren. In vielen Fällen konnte gezeigt werden, daß Kontrollfaktoren gemeinsame Strukturmotive aufweisen und zwischen den Organismen ausgetauscht werden können. Unsere Forschergruppe hat sich zum Ziel gesetzt, die Taufliege Drosophila und die Maus als Modellsysteme zu nutzen, um molekulare Mechanismen der Zell- und Organdifferenzierung vergleichend zu untersuchen. Wir wollen neu entwickelte Untersuchungsmethoden der Kombinatorischen Chemie, Biochemie und Pharmazie (Aptamere, Arzneistoffe) mit den Ansätzen der molekularen Zell- und Entwicklungsbiologie bei Drosophila und der Maus kombinieren. Dies verspricht nicht nur neue Lösungsansätze bei der Bearbeitung von zell- und entwicklungsbiologischen Fragestellungen, sondern auch neue mechanistische Erkenntnisse über die Struktur und Funktion von einzelnen Proteinen bzw. von "Proteinmaschinen". Die Beteiligung der medizinischen und pharmazeutischen Arbeitsgruppen erlaubt, neue experimentelle Strategien direkt für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen und die Entwicklung neuer Therapieansätze zu nutzen.

Projektbereich A2: Ziel unserer Untersuchungen ist es, nachzuweisen, ob ein Zusammenspiel von direkter Zell/Zell-Kommunikation durch Gap Junctions und anderen Signalwegen bei der Organentwicklung des Proventrikulus im Drosophila-Embryo vorliegt. Wir haben eine innexin-2-Mutante isoliert, bei der die Frühstadien der Proventrikulusentwicklung defekt sind. Es ist geplant, den mutanten Phänotyp der Embryonen mit molekularen und zellbiologischen Untersuchungsmethoden zu charakterisieren. Mit Hilfe eines "yeast-two-hybrid"-Screens und durch einen genetischen Mutagenese-Ansatz wollen wir Interaktionspartner von Inx-2 isolieren, welche die Reifung, Lokalisierung bzw. Funktion der Kanalproteine steuern. In Zusammenarbeit mit der AG Famulok planen wir, selektierte Aptamer-Inhibitoren in Zellkultur und in transgenen Fliegen zur Analyse der Inx-2-Funktion einzusetzen.

Projektbereich A4: Spinalganglien beherbergen eine Vielzahl hochspezialisierter somatosensorischer Neuronen, die für die Wahrnehmung thermischer, mechanischer, propriozeptiver und nozizeptiver Reize verantwortlich sind. Im Rahmen dieses Projektes sollen die molekularen Mechanismen, die die Differenzierung dieser heterogenen Neuronen steuern, mit Hilfe transgener Tiermodelle untersucht werden. Zunächst sollen dazu mit Hilfe von ‚knockin'-Methoden Mauslinien etabliert werden, die Reportergene unter der Kontrolle von endogenen Promotoren exprimieren. Wir werden für diese Experimente drei Gene verwenden, die in Subpopulationen von sensorischen Neuronen exprimiert sind: Das Tac1 Gen, welches für die Tachykinin-Neuropeptide Substanz P und Neurokinin A kodiert, das Gen für den Purin Rezeptor P2X3 und das Gen für den Amylorid-sensitiven Na-Kanal AsicIII (DRASIC). Anschliessend sollen diese Mauslinien beutzt werden, um die Funktion von Signalmolekülen, wie dem glial cell line-derived growth factor (GDNF) und dem nerve-growth-factor (NGF), sowie von Transkriptionsfaktoren (z.B. Neurogeninen) zu studieren.

Projektbereich B1: Ziele dieses Antrags sind a) die in vitro-Selektion von RNA-Aptameren, die die intrazellulären Domänen von Gap junction-Proteinen der Innexin-Familie aus Drosophila binden und ihre Funktion inhibieren. Durch die in vivo-Expression inhibitorischer Aptamere (Intramere) in Zellkultur und in transgenen Drosophila Fliegen sollen Regionen der Kanalproteine charakterisiert werden, die die Oligomerisierung, die Lokalisierung bzw. ihre Kopplung kontrollieren. In Zusammenarbeit mit dem AK Hoch wollen wir einen Assay zur Intramer-abhängigen in vivo-Analyse der Innexin-2-Funktion im Proventrikulus-Organ entwickeln. Mit Hilfe selektierter anti-Innexin-2-Intramere wollen wir die Aktivität von Gap junctions im Proventrikulus blockieren und untersuchen, ob Wingless- und Hedgehog-Signale bzw. Integrin-vermittelte Zelladhäsionsprozesse betroffen sind. Dieses Projekt bildet den Hauptteil des Antrags. b) die Selektion und Charakterisierung von Aptameren gegen kurze Peptidsequenzen, die dem 3. extrazellulären Loop (EL3) des G-Protein-gekoppelten Purinrezeptors P2Y2 entsprechen (mit AK Müller).

Projektbereich B2: Im Rahmen des Projektes sollen potente, selektive Agonisten, Antagonisten und Aptamere für P2-Rezeptor-Subtypen, insbesondere für die Pyrimidinnukleotid-sensitiven Rezeptoren P2Y2, P2Y4 und P2Y6 entwickelt werden. Ausgehend von ausgewählten Leitstrukturen (Uridinnukleotide, Anthrachinonsulfonsäuren) erfolgt die Synthese neuer Verbindungen und deren In-vitro-Testung an P2-Rezeptor-exprimierenden Zellkulturen. Darüber hinaus wird ein gezieltes Screening von ausgewählten Verbindungen, Substanzbibliotheken und Arzneipflanzenextrakten durchgeführt, um neue Leitstrukturen zu identifizieren. Die Suche nach neuen Leitstrukturen und die Analyse der Struktur-Wirkungsbeziehungen der neu synthetisierten P2-Rezeptorliganden wird durch Molecular-Modeling-Methoden unterstützt. Als Testsysteme stehen Radioligandbindungsstudien (für wenige Subtypen) und funktionelle Assays (fluorimetrische Bestimmung der intrazellulären Calciumkonzentration, Adenylatcyclase-Assays) zur Verfügung bzw. sollen neu etabliert werden. Des weiteren ist die Entwicklung von Radioliganden und Fluoreszenz-markierten Liganden für P2-Rezeptor-Subtypen geplant. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe Famulok sollen Aptamere gegen kurze Peptidsequenzen des spezieskonservierten 3. extrazellulären Loops des P2Y2-Rezeptors hergestellt und für histochemische Untersuchungen eingesetzt werden. Solche Aptamere könnten darüber hinaus als eine neue Klasse allosterischer Antagonisten von P2Y2-Rezeptoren fungieren. Mit den neu entwickelten pharmakologischen Tools sind Studien zur Rolle der P2-Rezeptoren in der Zellproliferation und -differenzierung geplant in Kooperation mit den anderen Arbeitsgruppen der Forschergruppe. Hierzu sollen Untersuchungen an verschiedenen Zellkulturen, nativem tierischem und menschlichem Gewebe und in vivo durchgeführt werden.


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